Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。
第四部分：數據分析
數據分析無法彌補低質量的FLIM數據，但可以從樣本和實驗優化設計后采集的數據里提取大量信息，詳情參考文獻[3]。以下部分僅介紹幾個要點，并在典型的 FLIM 數據上進行了演示。
選擇什么模型擬合?
關于FLIM數據分析的第一個問題通常是：我應該使用哪種模型？需要多少個衰減分量才能擬合結果？
答案并不取決于樣品實際具有的衰減分量的數量，而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此，除了你自己，沒有人能回答這個問題。你對特定生物系統中正在發生的事情有一個假設，你設計了一個實驗和一個樣本來確認或排除假設。只有你才能知道樣品中預期會發生什么，只有你才能知道衰減函數中預計會有多少分量。因此，你應該選擇不同的，并具有相應衰減分量數的模型（并且只有這個模型）來擬合數據。
比如，你正在做一個蛋白質相互作用實驗，采用FRET作為蛋白質相互作用的指示，用供體標記一種蛋白質，用受體標記另一種蛋白質。在蛋白質相互作用的地方應該發生FRET，FRET縮短了供體的熒光壽命。因此，您可以在供體發射波長處獲取FLIM數據。在 SPCImage 中加載數據并使用單指數模型運行分析。細胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預計的蛋白質相互作用的地方（圖30，左）。
您可以檢查圖像的幾個特征點中的衰減函數。在壽命較短的地方，單指數模型不能正確擬合衰減函數，但雙指數模型適合（圖 30，左二）。這是合理的：首先，并非所有供體分子都對受體具有正確的取向（FRET發生條件之一）。其次，蛋白質相互作用是一種化學平衡，應該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命，因此衰減曲線應該是雙指數的。
現在，您可以使用雙指數模型運行數據分析。對于顯示，請選擇振幅加權平均壽命 tm，這是經典 FRET 效率的表示，如圖 30 右二所示。接下來，選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比，該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對數量，它在細胞膜中蛋白質相互作用的地方最高，見圖30，右圖。結果表明，雙指數模型適合擬合數據，并且表明初始假設可能是正確的。
圖 30：FLIM-FRET 測量結果。從左到右：單指數壽命圖像，光標位置衰減曲線，雙指數模型的振幅加權壽命圖像（顯示經典FRET強度），振幅比圖像，顯示相互作用蛋白質的相對比值）。
選擇要顯示的參數
SPCImage提供了幾個選項來顯示衰減函數的參數：經典的單指數壽命，衰減分量的壽命，振幅加權平均值和強度加權平均的分量壽命值，以及衰減分量中包含的相對強度，參考文獻[3]，SPCImage 還顯示這些參數的比值。如果可能，應選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數組合。例如，在 FRET測量中，雙指數擬合的振幅加權壽命表示經典的 FRET效率，以及振幅之比 a1/a2（相互作用供體的相對比值）。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比，該參數表征細胞的代謝狀態。分量壽命（t1 和 t2）的圖像顯示在中間和右側，壽命的不均勻性表明NADH處在單個線粒體中的不同的分子環境。
圖31：從左到右：活細胞的NADH圖像。振幅比，a1/a2（未束縛/束縛比）以及快衰減分量（t1，未束縛的NADH）和慢衰減分量（t2，束縛的NADH）的圖像。FLIM數據格式 512×512像素。底部：選定點的衰減曲線，1024個時間通道，時間通道寬度 10ps。
Binning——“像素合并”
FLIM用戶通常不贊成將壽命數據合并，認為這是一種不科學地調整測量結果的方式。然而，正確的合并是任何準確可靠的FLIM數據分析的關鍵。光學系統成像時，空間分辨率受到衍射極限的限制，單點光的衍射圖稱為Airy圓盤或（在顯微鏡下）點擴散函數。為了達到衍射極限分辨率，數據不得通過像素化來模糊。根據經驗，點擴散函數的中心圓盤應約按 5 x 5像素采樣，當然，此區域內像素中的壽命信息非常相似。因此，將這些像素的時間數據組合用于FLIM分析是合適的，請參見圖32左。結果是光子數大幅增加，壽命精度相應提高。請注意，合并5 x 5像素區域會使凈光子數增加25倍！
在 SPCImage 軟件中，通過組合定義合并區域的數據并將凈衰減曲線分配給中心像素來執行合并。因此，圖像中的有效像素數不會改變，該程序還符合優質圖像的美學角度。從視覺上看，圖像在開始看起來很丑陋之前，包含大量的強度噪聲。然而，在FLIM應用中，壽命數據中相同數量的噪聲將使數據無用。因此，在具有一定強度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的，但壽命平均在更大的區域內，并且相應地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。
圖 32：左：對強度圖像中的 Airy 圓盤進行過采樣，以及合并像素用于壽命計算。右：用于壽命計算的像素重疊合并。
SPCImage 軟件中合并參數（binning parameter） n 的含義如圖 33 所示。請注意，合并系數2對應 5 x 5 像素區域，即大致對應于正確采樣圖像中點擴散函數的面積。無意中，圖像通常使用較高的過采樣率拍攝，尤其是在使用掃描儀的高變焦系數時。因此，SPCImage提供合并系數最多為10像素合并，對應 20 x 20 的像素區域。
圖 33：合并系數n的功能，‘Square’（左）和‘Circular’ （右）合并。
圖 34 給出了像素合并（binning）效果的演示，用512 x 512像素掃描BPEA樣品，將衰減曲線記錄到1024個時間通道中。未做像素合并的數據如圖 34 的頂行所示。左側顯示了（單指數）壽命圖像。在不進行像素合并的情況下，每個像素的光子數量極低，請參閱中圖。因此，壽命圖像看起來很嘈雜，衰減時間散布在各處，請參閱右側的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數據。采用圓形合并，合并系數為 2，對應21 個像素區域的合并。壽命圖像質量優異，凈衰減函數具有足夠的光子以進行合理擬合，并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出，顏色不會模糊，即像素合并不會對整個壽命的空間分辨率造成明顯的損失。
圖 34：像素合并（binning）在壽命分析中的影響。512 x 512 像素，1024 個時間通道。頂部：無合并。底部：合并系數 2，圓形合并，21個像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。
合并系數為2（將21個像素的衰減曲線合并到中心像素中，見圖33），合并后的數據甚至足以進行雙指數衰減分析。結果如圖 35 所示，頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像，以及兩個分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質量。底行顯示參數直方圖，它們表明，分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的（請注意不同的參數范圍）。
圖 35：與圖 34 中底行數據相同，雙指數衰減分析。從左到右：快分量的壽命圖像t1，慢分量的壽命圖像t2，振幅比圖像a1/a2。請注意不同的參數范圍。
圖36顯示了合并對壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細胞中心70 x 70像素區域的數據。正如預期的那樣，在合并系數≤2時，壽命對比度基本保持不變，請參考中心的花狀結構。對于 4 和 6（右2和右1）的合并系數，壽命對比度開始降低。來自相鄰像素的太多衰減數據被混合到凈衰減函數中，因此，中間的結構越來越多地采用其更周圍緊鄰環境的壽命值。
圖36：放大圖34數據的70 x 70像素區域，顯示大細胞的中心。不同的合并系數，從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2（中心圖像），使用壽命對比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時壽命對比度會降低，這可以從中心結構顏色的褪色中看出。
圖像分割
與合并空間相關像素合并（binning）相比，圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。
該過程如圖37左上所示，圖37顯示了SPCImage面板，其中包含低光子數的FLIM數據，數據與圖 34 上行中的數據相同，所選像素中的衰減數據顯示在面板的右下角。根據這些數據計算出的壽命圖像是嘈雜的，并且壽命的直方圖（右上）非常寬。下一步如圖 37（右上方）所示。相量圖（phasor plot）是根據數據計算得出的，不出所料，相量分散在各處。
然而，壽命明顯不同的像素的相量（由顏色表示）出現在不同的相位/振幅位置。
在第三步中，選種一系列相量值，并在壽命圖像中突出顯示相應的像素，請參見圖 37 左下角。可以移動選擇區域，更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結構。在所示的示例中，已選擇細胞的線粒體。即使選擇可能不完整，所選像素也都在圖像的所需結構內。
在最后一步，圖37，右下角，所選像素的衰減數據被組合成一條衰減曲線，這條曲線包含超過300萬個光子。相比之下，圖34中單個像素中只有幾百個光子，在n=2的合并區域中大約有3000個光子。具有300萬光子的衰減曲線可以進行高精度分析，三指數分析很輕松，如圖 37 右下角所示，三指數衰減參數顯示在面板的右上方。
圖37：通過相量圖進行圖像分割，并將所選像素組合成高光子數的單衰減曲線。
固定分量的壽命進行分析
如果減少衰減參數的數量，多指數衰減分析將變得更加容易。因此，在數據分析中包括先驗知識可以減少結果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開放性腫瘤的NADH圖像，用bh DCS-120 MACRO系統成像，有趣的參數是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例，并指示組織相應區域的新陳代謝類型。因此，使用雙指數模型對數據進行分析，并創建了a1圖像。使用所有參數（t1，t2，a1，a2）自由浮動來分析左側的圖像，固定t2分析右側的圖像。不出所料，右側的圖像噪點較小，腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側的直方圖甚至顯示兩個不同的像素群，一個為 a1 = 0.65，另一個為 a1 = 0.83，這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發現的振幅。
圖38：小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左：T1、t2、a1、a2浮動。右：t2 固定為最常用值，2400 ps。下行：圖像像素上 a1 的直方圖。
在衰減分量的壽命預計恒定的情況下，使用固定參數進行分析可以大大降低噪聲。但是，必須謹慎使用該技術，熒光壽命從來都不是絕對恒定的，分子環境總是有影響的。如果分量壽命是固定的，但不是絕對恒定的，則擬合過程會以其他參數的較大變化來響應。因此，在固定分量壽命條件下，獲得的擬合結果可能具有較大的系統誤差。
最后一步：圖像強度和參數范圍
FLIM圖像應清晰明了地展示相關論文中聲稱的科學事實，圖像不僅應顯示正確的衰減參數，還應將其顯示在適當的強度和衰減參數范圍內。默認情況下，SPCImage 使用強度自動縮放，在正常情況下，自動縮放會產生合理的圖像。但是，自動縮放功能無法知道圖像的哪個部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區域，則自動縮放不一定能提供最佳圖像。此外，其他完美的圖像也可能包含一些過于明亮的點。在這些情況下，無論它們來自何處，自動縮放都不會生成合理縮放的圖像，因此，應關閉自動縮放，并手動調整強度刻度。圖39 顯示了一個示例，自動縮放（左）會導致不良的縮放強度范圍，手動調整強度范圍可生成正確平衡的圖像（右圖）。
具有不同參數比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示，這些圖像顯示了分別以藍-綠-紅和紅-綠-藍兩色方向顯示的壽命圖像。參數范圍為 2000 到 3000 ps（左）和 2300 到 2700 ps（右）。哪種風格最能體現感興趣的效果，必須根據具體情況來決定。
圖39：包含一些非常亮點的圖像。左：強度范圍的自動縮放，自動縮放功能可將強度縮放到最亮的特征，獲得的強度范圍不適合圖像的其余部分。右：手動縮放可在正確的強度范圍內生成圖像，單指數擬合的壽命，顏色范圍從2000 ps（藍色）到 3000 ps（紅色）。
圖40：圖39所示數據的不同表示形式，單指數壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
圖 41：圖 39 中所示數據的不同表示形式，單指數壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
總結
熒光壽命可以從TCSPC FLIM數據中得出，信噪比接近每像素光子數的平方根。因此，表征FLIM數據質量的最重要參數是光子數。通過使用實際示例，我們已經證明，通過簡單地優化探測效率和采集時間，可以獲得光子數為10倍。通過使用高效率的探測器，可以增加4倍，優化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之，這是光子數為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說在所有情況下都可以達到如此大的改進，但幾乎在任何時候都可以實現相當大的改進。
FLIM系統的第二個重要參數是光子效率，光子效率描述了系統探測到的單個光子對結果的貢獻程度。換句話說，它描述了系統與理想信噪比SQRT（N）的接近程度。雖然TCSPC系統接近理想，但光子效率通常可以通過使用正確的TCSPC定時參數，避免記錄背景信號以及使用足夠快IRF的探測器來優化。通常，光子效率提高兩到四倍是可能的，只需遵守一些簡單的信號記錄規則即可。
當記錄和分析多指數衰減函數時，數據質量變得尤為重要。在最常見的FLIM應用中，多指數衰減是必須的。然后，信息主要在于衰減分量的振幅和壽命，而不是凈衰減函數的表觀壽命。這意味著不僅探測效率和光子效率很重要，儀器響應函數IRF的寬度也很重要。此外，解析多指數衰減函數的選項在很大程度上取決于衰減函數的形狀，它們偏離單指數曲線的距離越大，就越能很好地分辨它們。因此，考慮好FLIM選項的實驗規劃和樣品優化設計可以對研究的結果產生巨大影響。
最后，數據分析在任何FLIM實驗中都起著重要作用，正確應用的數據分析可以從記錄的數據中提取最大數量的信息。此外，它能夠以出版就緒的風格呈現數據，令人信服地支持相關出版物中提出的科學主張。
References
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
3. SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH(2019)
4. W. Becker (ed.), Advanced time-correlated single photon counting applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015)
5. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 87th ed. (2019).?Available on www.becker-hickl.com
6. Becker & Hickl GmbH, Modular FLIM systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes.?User handbook. Available on www.becker-hickl.com
7. Becker & Hickl GmbH, FLIM systems from Zeiss LSM 980 Laser scanning microscopes, addendum to modular FLIM?systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes. Available on www.becker-hickl.com
8. Fast-Acquisition TCSPC FLIM: What are the Options? Application note, available from www.becker-hickl.com
9. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky, Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime?Effects by Line-Scanning TCSPC. Microsc. Res. Techn. 77, 216-224 (2014)
10. R.M. Ballew, J.N. Demas, An error analysis of the rapid lifetime determination method for the evaluation of single?exponential decays, Anal. Chem. 61, 30 (1989)
11. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased?Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. Micr. Res. Tech. 74, 804-811 (2011)
12. Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Axel Bergmann, Two-photon FLIM of mushroom spores reveals ultra-fast decay component. Application note, available on www.becker-hickl.com.
13. Becker & Hickl GmbH, Ultra-fast HPM detectors improve NADH FLIM. Application note, www.becker-hickl.com
14. Becker & Hickl GmbH, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, www.becker-hickl.com
15. Becker Wolfgang, Suarez-Ibarrola Rodrigo, Miernik Arkadiusz, Braun Lukas, Metabolic Imaging by Simultaneous?FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)
16. H.C. Gerritsen, M.A.H. Asselbergs, A.V. Agronskaia, W.G.J.H.M. van Sark, Fluorescence lifetime imaging in?scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution, J. Microsc. 206, 218-224 (2002)
17. M. K?llner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements?, Phys. Chem. Lett.?200, 199-204 (1992)
18. I. Isenberg, R.D. Dyson, The analysis of fluorescence decay by a method of moments. Biophys. J. 9, 1337-1350 (1969)
