Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準(zhǔn)精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。
第二部分：優(yōu)化（增加）光子數(shù)
激發(fā)功率
當(dāng)FLIM用戶希望增加光子數(shù)時，第一個想法通常是增加激發(fā)功率。這當(dāng)然是獲得更多光子的有效方法，但它并不總是有助于獲得更好的FLIM結(jié)果。FLIM實驗通常在熒光團濃度低的樣品上進行，原因是只有當(dāng)熒光團本身對細(xì)胞的活力或其代謝功能沒有明顯影響時，才能看到分子效應(yīng)。此外，熒光團可能具有較低的量子效率。如果增加激發(fā)功率，分子必須執(zhí)行更多的激發(fā)–發(fā)射循環(huán)，結(jié)果是光漂白，形成自由基，激光誘導(dǎo)壽命變化，光損傷，甚至樣品完全被破壞。然后，成像過程不再是非侵入性的，FLIM結(jié)果變得毫無意義。因此，增加激光功率的選擇是有限的（參考文獻(xiàn)[8]）。侵入性效應(yīng)的幾個例子如圖8所示。
圖8：左：Convallaria圖像，用405nm激光掃描的中心區(qū)域。中：活細(xì)胞的雙光子NADH圖像。在明亮的紅色斑點中，發(fā)生了光損傷，通過非常快速衰減的斑點表現(xiàn)出來。右圖：酵母細(xì)胞的時域馬賽克拼接FLIM圖像，采用780nm雙光子激發(fā)。記錄從左下角開始，一直到拼接圖的右上角。破壞從第8和9格開始，一直持續(xù)到第16格。
采集時間
與增加激發(fā)功率不同，增加采集時間通常是一種不錯的選擇，損傷效果是高度非線性的。通常，可以用僅略低于損傷閾值的功率長時間掃描樣品，可增加光子數(shù)，所需要的只是實驗者的耐心。圖 9 顯示了一個示例。左邊的圖像采集時間為1分鐘，右邊的圖像采集時間為2分鐘。結(jié)果是，右邊的圖像包含2倍以上的光子。正如預(yù)期的那樣，它還提供了1.4倍的壽命SNR，參考圖像下方的壽命直方圖。
圖9：以不同的采集時間對同一樣品進行成像，左圖 1 分鐘，右圖2 分鐘。圖像格式512×512像素，1024個時間通道。
雖然光子數(shù)（以及壽命精度）和采集時間的相關(guān)性是微不足道的，但FLIM用戶通常不會意識到這一點。特別是來自傳統(tǒng)基于強度的成像的用戶，當(dāng)達(dá)到強度圖像的合理SNR時，往往會停止采集。但是，這存在一個謬誤。當(dāng)強度圖像每像素包含不超過幾十個光子時，它開始看起來不錯。這種圖像的SNR可能足以區(qū)分不同的熒光團，但不足以從熒光壽命中得出所需的分子信息。因此，請確保采集時間足夠長。我們的SPCM采集軟件提供了許多選項，用于在采集過程中查看光子數(shù)。您可以在所選像素或感興趣區(qū)域中顯示衰減曲線，可以在最亮的像素和所選像素中顯示光子數(shù)，并且可以在線顯示壽命圖像。請參見圖 10，使用這些選項，您應(yīng)該能確定到目前為止記錄的數(shù)據(jù)是否足以進行進一步分析。如有不夠，請記錄更長時間。
圖10：SPCM幫助用戶確定是否記錄了足夠光子數(shù)的功能。從左到右：在線壽命圖像，選定位置的衰減曲線，最亮像素（頂部）中的光子數(shù)和數(shù)據(jù)點位置的光子數(shù)。
有時有人反對說，當(dāng)要觀察生理變化時，無法采用較長的采集時間。然而，如果使用適當(dāng)?shù)亩嗑STCSPC技術(shù)，這并不一定，請看（參考文獻(xiàn)[2，9]）。
顯微物鏡
顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑對探測效率有顯著影響。熒光以各向同性方式發(fā)射，只有一部分被顯微物鏡收集。從理論上講，收集效率隨著數(shù)值孔徑的增加而成平方倍增加。這意味著NA 1.25的物鏡應(yīng)該比NA 0.5的物鏡收集6倍以上的光子數(shù)。但在實踐中，差異會小一些，因為高數(shù)值孔徑物鏡具有更多的光學(xué)元件和更低的透過率。然而，收集效率的差異是驚人的。圖 11 顯示了一個示例。兩幅圖像都采用單光子激發(fā)和共聚焦探測記錄的。左圖像用NA 0.5的x20空氣鏡記錄，右圖像用NA 1.25的x63油鏡記錄。使用高數(shù)值孔徑物鏡記錄的圖像包含的光子是低數(shù)值孔徑下記錄的圖像的三倍。
圖11：使用不同NA的物鏡記錄的FLIM圖像，相同的強度尺度，單光子激發(fā)，共聚焦探測。左：X20 空氣鏡，NA 0.5，右：X63油鏡，NA 1.25.
聚焦
對焦不佳通常被認(rèn)為是空間分辨率欠佳的來源，同時，它對探測效率也有顯著影響。圖 12 顯示了一個示例，兩幅圖像均通過共聚焦掃描記錄，針孔尺寸相同，采集時間相同。左圖略微失焦，盡管如此，圖像清晰度只是略受損。右圖完全對焦。可以很容易地看出，正確對焦的圖像更亮。與失焦圖像相比，光子的數(shù)量大約高出1.5倍。由于FLIM系統(tǒng)顯示強度歸一化圖像（這樣做是因為強度的差異可能時數(shù)量級的），因此通常不會注意到這些差異。因此，當(dāng)您在“預(yù)覽”模式下進行最終對焦時，請花幾秒鐘在關(guān)閉自動縮放功能的情況下優(yōu)化對焦。
圖 12：左圖略微失焦，右圖完全對焦。相同強度尺度，單光子激發(fā)，共聚焦探測。雖然失焦圖像中的圖像清晰度僅略受損，但光子數(shù)僅為完美圖像中光子數(shù)的60%。圖像格式512 x 512像素，1024個時間通道。
光學(xué)系統(tǒng)的對準(zhǔn)
光學(xué)系統(tǒng)的對準(zhǔn)對探測效率有巨大的影響，共聚焦系統(tǒng)尤其如此。共聚焦對準(zhǔn)非常關(guān)鍵，幾乎沒有一個共聚焦系統(tǒng)可以長時間保持完美對準(zhǔn)。圖 13 顯示了一個示例，左邊的圖像是在針孔對準(zhǔn)稍微偏離的情況下采集的，幾乎在任何共聚焦系統(tǒng)中都可以發(fā)現(xiàn)這樣水平的失準(zhǔn)。通常，它不被注意到，因為圖像清晰度幾乎沒有受到損害。然而，與來自完美對準(zhǔn)系統(tǒng)的圖像進行比較（圖13，右），記錄的光子數(shù)量存在明顯的損失。某些情況的失準(zhǔn)甚至導(dǎo)致圖像清晰度可見的下降，可導(dǎo)致光子數(shù)的巨大損失，在這些情況下，效率下降一個數(shù)量級甚至更多并不罕見。
圖 13：共聚焦對準(zhǔn)的效果。左：略微失準(zhǔn)。右：完美對準(zhǔn)。雖然不對準(zhǔn)尚未導(dǎo)致圖像清晰度的可見下降，但它會導(dǎo)致50%的光子損失。
在非解掃探測（NDD）的多光子系統(tǒng)中，失準(zhǔn)甚至也可能導(dǎo)致影響。雖然這些系統(tǒng)的探測光路很可靠，很少失準(zhǔn)，但激發(fā)光路卻存在失準(zhǔn)的可能。多光子顯微鏡的飛秒激光需要空間光耦合到掃描頭中，這為光路提供了許多可能偏離對準(zhǔn)的可能，這導(dǎo)致激光不再集中在顯微物鏡的后孔徑中間。結(jié)果，聚焦質(zhì)量下降，激發(fā)效率降低，光漂白和光損傷并不總是以相同的比例減少，特別是如果樣品在激光的本身的波長上有一定的吸收。因此，多光子系統(tǒng)也應(yīng)該定期重新對準(zhǔn)。這可以通過檢查激光束在物鏡后孔徑上的位置，并將其調(diào)回中心來輕松完成。
探測器
多年來，激光掃描顯微鏡，特別是FLIM系統(tǒng)，一直使用傳統(tǒng)的光電倍增管（PMT）作為探測器。PMT具有較大的有效面積，每平方毫米有效面積的暗計數(shù)率極低，并且有足夠的增益和速度來探測單個光子。具有常規(guī)光陰極的PMT的光陰極的量子效率約為20%，然而，并非每個由陰極發(fā)射的光電子都進入放大系統(tǒng)并提供有用的單電子脈沖。因此，凈效率約為15%。隨著采用帶有GaAsP陰極的PMT，效率有所提高，這些陰極的量子效率接近50%。如濱松的H7422 GaAsP PMT，已經(jīng)用于FLIM多年。然而，這些探測器的儀器響應(yīng)（IRF）寬度約為250至350 ps，這對于高端FLIM應(yīng)用來說是不夠的。隨著濱松R10467-40混合型PMT的推出，情況完全改變了，混合型PMT的原理保證了幾乎所有離開陰極的光電子都能提供單電子脈沖。憑借其GaAsP光電陰極，R10467-40的凈探測效率達(dá)到50%。IRF快速而干凈，并且沒有像傳統(tǒng)PMT那樣的后脈沖背景。但R10467-40不易使用，它需要 -8000 V 和 +400 V 電源電壓、可靠的過載保護、高增益前置放大器和出色的射頻屏蔽。bh是第一個解決這些問題的公司，并將這種探測器完全應(yīng)用到其FLIM系統(tǒng)（參考文獻(xiàn)[11]）。不同探測器效率的比較可以在“bh TCSPC手冊”（參考文獻(xiàn)[2]）的“TCSPC探測器”一章中找到。
圖 14 顯示了一個實際示例。左邊的圖像是用傳統(tǒng)的PMT（bh PMC-100-0模塊）記錄的，右邊的圖像是用GaAsP混合型PMT（bh HPM-100-40模塊）記錄的。采用GaAsP混合探測器的光子數(shù)約為4.2倍。
圖 14：使用傳統(tǒng) PMT（bh PMC-100-0，左）和混合型 PMT（bh HPM-100-40，右）記錄的 FLIM 圖像。相同的成像條件，相同的采集時間。HPM-100-40圖像包含的光子是使用傳統(tǒng)PMT拍攝的圖像的4.2倍。
像素數(shù)
獲得的壽命的SNR與每個像素的光子數(shù)成正比。因此，原則上，光子限制條件下的SNR可以通過減少像素數(shù)量來增加。例如，128 x 128 像素的圖像只需要 512 x 512 像素圖像的 1/16 光子。這種方法的缺陷在于，它用壽命精度與空間分辨率進行了權(quán)衡。除非有其他使用低像素數(shù)的必要（例如限制的數(shù)據(jù)大小或需要快速掃描），否則不建議將像素數(shù)降低到256 x 256 以下。更好的方法是使用足夠空間采樣的像素數(shù)記錄圖像，而在數(shù)據(jù)分析中使用像素合并（參考文獻(xiàn)[3]），有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱第四部分——“數(shù)據(jù)分析”。數(shù)據(jù)分析中的像素合并使像素數(shù)保持不變，但會對當(dāng)前像素及其周圍像素的衰減數(shù)據(jù)之和運行壽命分析。
其優(yōu)點是空間分辨率沒有損失，也沒有空間欠采樣，并且您可以自由地在記錄的數(shù)據(jù)上選擇最佳的像素合并因子。圖 15 顯示了一個示例。頂行的數(shù)據(jù)以128 x 128像素掃描記錄，底行的數(shù)據(jù)通過512 x 512像素掃描記錄，兩個記錄都包含相同的光子總數(shù)。因此，512 x 512 像素掃描的每像素光子數(shù)要低 16 倍。然而，較低的光子數(shù)可通過數(shù)據(jù)分析軟件中的像素合并來補償?shù)摹Ｒ虼耍總€合并區(qū)域（底行）的衰減曲線包含與每個像素衰減曲線（頂行）相同的光子數(shù)。因此，兩個記錄的壽命直方圖（如右圖所示）具有相同的寬度。但是，來自512 x 512像素掃描的圖像（底行，左）比來自128 x 128像素掃描的圖像（頂行，左）清晰得多。請參閱“數(shù)據(jù)分析”部分。
圖 15：使用不同像素數(shù)記錄的 FLIM 數(shù)據(jù)。相同的采集時間，相同的光子總數(shù)，上行128 x 128 像素，下行 512 x 512 像素。從左到右：圖像、光標(biāo)位置的衰減曲線、壽命直方圖。使用像素合并對512 x 512像素的圖像進行分析，以補償每像素的較低光子數(shù)。
References
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