與使用TAC/ADC原理的SPC-130、-150、-160和-180 TCSPC模塊不同，SPC-QC系列使用直接時間數字（TDC）轉換，下圖說明了這兩種轉換方式的原理。

TAC/ADC原理如左圖所示：它使用起始脈沖（通常是光子通道）和停止脈沖（通常是來自激光的參考脈沖）之間的線性電壓斜坡定時，電壓差值轉換為數字信號，該信號表示激光脈沖序列中光子的時間。

TDC原理如右圖所示：來自探測器的光子脈沖和來自激光的參考脈沖分別被送入延遲單元鏈。時序邏輯查看延遲鏈中的數據，識別光子和激光脈沖的啟動-停止對，并以這種方式確定光子在激光脈沖序列中的時間位置。從這些數據中，建立起TCSPC/FLIM的光子分布。

TDC原理的優點是，定時電子可以在FPGA（現場可編程門陣列）中實現，因此，可以在一個TCSPC板上實現多個記錄通道。TDC優于TAC的另一個特點是，TDC原理可以達到極高的計數率，甚至每個激光脈沖可能檢測到幾個光子。在實踐中，計數率受到堆疊、探測器-鑒別器組合中的死時間、高計數率下探測器定時性能的下降，當然，還受到樣品提供計數率的能力的限制。

缺點是，時間分辨率遠低于TAC/ADC原理。下圖，SPC-180NXX和SPC-QC-104的電子IRF進行了比較。SPC-180NXX（左）的IRF寬度為2.8 ps FWHM，SPC-QC-104（右）的IRF寬度為39 ps FWHM。雖然39 ps FWHM對TDC來說還算不錯，但SPC-QC-104沒有利用超快探測器的全時分辨率，如SSPD、MCP-PMT和超快混合型PMT探測器。

另一個關鍵差異是定時穩定性，多年來，定時穩定性一直是TDC的一個問題。在SPC-QC-104中，穩定性問題在很大程度上已被新的TDC邏輯結構所克服。下圖顯示了SPC-180 NXX和SPC-QC-104的定時穩定性的比較：對于SPC-180 NXX，IRF第一矩的穩定性優于0.4 ps RMS，對于SPC-QC-104，它優于5 ps RMS（注意不同的時間尺度）。雖然SPC-QC沒有達到SPC-180NXX的穩定性，但可能的定時漂移仍然遠低于IRF寬度，因此在實際應用中很少是一個問題。

結論

SPC-QC-104是基于TDC的TCSPC FLIM模塊，它有三個并行的TCSPC/FLIM通道和一個通用參考通道。或者，這些模塊可以作為四個并聯的絕對光子定時通道進行操作。該模塊具有高峰值計數率和相當快的時間分辨率。SPC-QC-104的電子IRF寬度<39 ps FWHM，內部定時抖動<19 ps RMS，定時穩定性為5 ps RMS，可用于大部分熒光衰減和FLIM應用。SPC-QC-104在需要多個并行檢測通道的應用中特別有優勢，SPC-150或-180模塊的多模塊系統似乎過于笨重或耗電。缺點是，SPC-QC-104沒有利用超快單光子探測器的全時分辨率，如SSPD、MCP-PMT或混合型PMT。在具有此類探測器的應用中，應使用bh SPC系列，最好使用SPC-180NX或SPC-180NXX。

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。

第四部分：數據分析

數據分析無法彌補低質量的FLIM數據，但可以從樣本和實驗優化設計后采集的數據里提取大量信息，詳情參考文獻[3]。以下部分僅介紹幾個要點，并在典型的 FLIM 數據上進行了演示。

選擇什么模型擬合?

關于FLIM數據分析的第一個問題通常是：我應該使用哪種模型？需要多少個衰減分量才能擬合結果？

答案并不取決于樣品實際具有的衰減分量的數量，而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此，除了你自己，沒有人能回答這個問題。你對特定生物系統中正在發生的事情有一個假設，你設計了一個實驗和一個樣本來確認或排除假設。只有你才能知道樣品中預期會發生什么，只有你才能知道衰減函數中預計會有多少分量。因此，你應該選擇不同的，并具有相應衰減分量數的模型（并且只有這個模型）來擬合數據。

比如，你正在做一個蛋白質相互作用實驗，采用FRET作為蛋白質相互作用的指示，用供體標記一種蛋白質，用受體標記另一種蛋白質。在蛋白質相互作用的地方應該發生FRET，FRET縮短了供體的熒光壽命。因此，您可以在供體發射波長處獲取FLIM數據。在 SPCImage 中加載數據并使用單指數模型運行分析。細胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預計的蛋白質相互作用的地方（圖30，左）。

您可以檢查圖像的幾個特征點中的衰減函數。在壽命較短的地方，單指數模型不能正確擬合衰減函數，但雙指數模型適合（圖 30，左二）。這是合理的：首先，并非所有供體分子都對受體具有正確的取向（FRET發生條件之一）。其次，蛋白質相互作用是一種化學平衡，應該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命，因此衰減曲線應該是雙指數的。

現在，您可以使用雙指數模型運行數據分析。對于顯示，請選擇振幅加權平均壽命 tm，這是經典 FRET 效率的表示，如圖 30 右二所示。接下來，選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比，該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對數量，它在細胞膜中蛋白質相互作用的地方最高，見圖30，右圖。結果表明，雙指數模型適合擬合數據，并且表明初始假設可能是正確的。

圖 30：FLIM-FRET 測量結果。從左到右：單指數壽命圖像，光標位置衰減曲線，雙指數模型的振幅加權壽命圖像（顯示經典FRET強度），振幅比圖像，顯示相互作用蛋白質的相對比值）。

選擇要顯示的參數

SPCImage提供了幾個選項來顯示衰減函數的參數：經典的單指數壽命，衰減分量的壽命，振幅加權平均值和強度加權平均的分量壽命值，以及衰減分量中包含的相對強度，參考文獻[3]，SPCImage 還顯示這些參數的比值。如果可能，應選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數組合。例如，在 FRET測量中，雙指數擬合的振幅加權壽命表示經典的 FRET效率，以及振幅之比 a1/a2（相互作用供體的相對比值）。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比，該參數表征細胞的代謝狀態。分量壽命（t1 和 t2）的圖像顯示在中間和右側，壽命的不均勻性表明NADH處在單個線粒體中的不同的分子環境。

圖31：從左到右：活細胞的NADH圖像。振幅比，a1/a2（未束縛/束縛比）以及快衰減分量（t1，未束縛的NADH）和慢衰減分量（t2，束縛的NADH）的圖像。FLIM數據格式 512×512像素。底部：選定點的衰減曲線，1024個時間通道，時間通道寬度 10ps。

Binning——“像素合并”

FLIM用戶通常不贊成將壽命數據合并，認為這是一種不科學地調整測量結果的方式。然而，正確的合并是任何準確可靠的FLIM數據分析的關鍵。光學系統成像時，空間分辨率受到衍射極限的限制，單點光的衍射圖稱為Airy圓盤或（在顯微鏡下）點擴散函數。為了達到衍射極限分辨率，數據不得通過像素化來模糊。根據經驗，點擴散函數的中心圓盤應約按 5 x 5像素采樣，當然，此區域內像素中的壽命信息非常相似。因此，將這些像素的時間數據組合用于FLIM分析是合適的，請參見圖32左。結果是光子數大幅增加，壽命精度相應提高。請注意，合并5 x 5像素區域會使凈光子數增加25倍！

在 SPCImage 軟件中，通過組合定義合并區域的數據并將凈衰減曲線分配給中心像素來執行合并。因此，圖像中的有效像素數不會改變，該程序還符合優質圖像的美學角度。從視覺上看，圖像在開始看起來很丑陋之前，包含大量的強度噪聲。然而，在FLIM應用中，壽命數據中相同數量的噪聲將使數據無用。因此，在具有一定強度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的，但壽命平均在更大的區域內，并且相應地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。

圖 32：左：對強度圖像中的 Airy 圓盤進行過采樣，以及合并像素用于壽命計算。右：用于壽命計算的像素重疊合并。

SPCImage 軟件中合并參數（binning parameter） n 的含義如圖 33 所示。請注意，合并系數2對應 5 x 5 像素區域，即大致對應于正確采樣圖像中點擴散函數的面積。無意中，圖像通常使用較高的過采樣率拍攝，尤其是在使用掃描儀的高變焦系數時。因此，SPCImage提供合并系數最多為10像素合并，對應 20 x 20 的像素區域。

圖 33：合并系數n的功能，‘Square’（左）和‘Circular’ （右）合并。

圖 34 給出了像素合并（binning）效果的演示，用512 x 512像素掃描BPEA樣品，將衰減曲線記錄到1024個時間通道中。未做像素合并的數據如圖 34 的頂行所示。左側顯示了（單指數）壽命圖像。在不進行像素合并的情況下，每個像素的光子數量極低，請參閱中圖。因此，壽命圖像看起來很嘈雜，衰減時間散布在各處，請參閱右側的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數據。采用圓形合并，合并系數為 2，對應21 個像素區域的合并。壽命圖像質量優異，凈衰減函數具有足夠的光子以進行合理擬合，并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出，顏色不會模糊，即像素合并不會對整個壽命的空間分辨率造成明顯的損失。

圖 34：像素合并（binning）在壽命分析中的影響。512 x 512 像素，1024 個時間通道。頂部：無合并。底部：合并系數 2，圓形合并，21個像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。

合并系數為2（將21個像素的衰減曲線合并到中心像素中，見圖33），合并后的數據甚至足以進行雙指數衰減分析。結果如圖 35 所示，頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像，以及兩個分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質量。底行顯示參數直方圖，它們表明，分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的（請注意不同的參數范圍）。

圖 35：與圖 34 中底行數據相同，雙指數衰減分析。從左到右：快分量的壽命圖像t1，慢分量的壽命圖像t2，振幅比圖像a1/a2。請注意不同的參數范圍。

圖36顯示了合并對壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細胞中心70 x 70像素區域的數據。正如預期的那樣，在合并系數≤2時，壽命對比度基本保持不變，請參考中心的花狀結構。對于 4 和 6（右2和右1）的合并系數，壽命對比度開始降低。來自相鄰像素的太多衰減數據被混合到凈衰減函數中，因此，中間的結構越來越多地采用其更周圍緊鄰環境的壽命值。

圖36：放大圖34數據的70 x 70像素區域，顯示大細胞的中心。不同的合并系數，從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2（中心圖像），使用壽命對比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時壽命對比度會降低，這可以從中心結構顏色的褪色中看出。

圖像分割

與合并空間相關像素合并（binning）相比，圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。

該過程如圖37左上所示，圖37顯示了SPCImage面板，其中包含低光子數的FLIM數據，數據與圖 34 上行中的數據相同，所選像素中的衰減數據顯示在面板的右下角。根據這些數據計算出的壽命圖像是嘈雜的，并且壽命的直方圖（右上）非常寬。下一步如圖 37（右上方）所示。相量圖（phasor plot）是根據數據計算得出的，不出所料，相量分散在各處。

然而，壽命明顯不同的像素的相量（由顏色表示）出現在不同的相位/振幅位置。

在第三步中，選種一系列相量值，并在壽命圖像中突出顯示相應的像素，請參見圖 37 左下角。可以移動選擇區域，更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結構。在所示的示例中，已選擇細胞的線粒體。即使選擇可能不完整，所選像素也都在圖像的所需結構內。

在最后一步，圖37，右下角，所選像素的衰減數據被組合成一條衰減曲線，這條曲線包含超過300萬個光子。相比之下，圖34中單個像素中只有幾百個光子，在n=2的合并區域中大約有3000個光子。具有300萬光子的衰減曲線可以進行高精度分析，三指數分析很輕松，如圖 37 右下角所示，三指數衰減參數顯示在面板的右上方。

圖37：通過相量圖進行圖像分割，并將所選像素組合成高光子數的單衰減曲線。

固定分量的壽命進行分析

如果減少衰減參數的數量，多指數衰減分析將變得更加容易。因此，在數據分析中包括先驗知識可以減少結果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開放性腫瘤的NADH圖像，用bh DCS-120 MACRO系統成像，有趣的參數是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例，并指示組織相應區域的新陳代謝類型。因此，使用雙指數模型對數據進行分析，并創建了a1圖像。使用所有參數（t1，t2，a1，a2）自由浮動來分析左側的圖像，固定t2分析右側的圖像。不出所料，右側的圖像噪點較小，腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側的直方圖甚至顯示兩個不同的像素群，一個為 a1 = 0.65，另一個為 a1 = 0.83，這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發現的振幅。

圖38：小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左：T1、t2、a1、a2浮動。右：t2 固定為最常用值，2400 ps。下行：圖像像素上 a1 的直方圖。

在衰減分量的壽命預計恒定的情況下，使用固定參數進行分析可以大大降低噪聲。但是，必須謹慎使用該技術，熒光壽命從來都不是絕對恒定的，分子環境總是有影響的。如果分量壽命是固定的，但不是絕對恒定的，則擬合過程會以其他參數的較大變化來響應。因此，在固定分量壽命條件下，獲得的擬合結果可能具有較大的系統誤差。

最后一步：圖像強度和參數范圍

FLIM圖像應清晰明了地展示相關論文中聲稱的科學事實，圖像不僅應顯示正確的衰減參數，還應將其顯示在適當的強度和衰減參數范圍內。默認情況下，SPCImage 使用強度自動縮放，在正常情況下，自動縮放會產生合理的圖像。但是，自動縮放功能無法知道圖像的哪個部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區域，則自動縮放不一定能提供最佳圖像。此外，其他完美的圖像也可能包含一些過于明亮的點。在這些情況下，無論它們來自何處，自動縮放都不會生成合理縮放的圖像，因此，應關閉自動縮放，并手動調整強度刻度。圖39 顯示了一個示例，自動縮放（左）會導致不良的縮放強度范圍，手動調整強度范圍可生成正確平衡的圖像（右圖）。
具有不同參數比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示，這些圖像顯示了分別以藍-綠-紅和紅-綠-藍兩色方向顯示的壽命圖像。參數范圍為 2000 到 3000 ps（左）和 2300 到 2700 ps（右）。哪種風格最能體現感興趣的效果，必須根據具體情況來決定。

圖39：包含一些非常亮點的圖像。左：強度范圍的自動縮放，自動縮放功能可將強度縮放到最亮的特征，獲得的強度范圍不適合圖像的其余部分。右：手動縮放可在正確的強度范圍內生成圖像，單指數擬合的壽命，顏色范圍從2000 ps（藍色）到 3000 ps（紅色）。

圖40：圖39所示數據的不同表示形式，單指數壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。

圖 41：圖 39 中所示數據的不同表示形式，單指數壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。

總結

熒光壽命可以從TCSPC FLIM數據中得出，信噪比接近每像素光子數的平方根。因此，表征FLIM數據質量的最重要參數是光子數。通過使用實際示例，我們已經證明，通過簡單地優化探測效率和采集時間，可以獲得光子數為10倍。通過使用高效率的探測器，可以增加4倍，優化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之，這是光子數為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說在所有情況下都可以達到如此大的改進，但幾乎在任何時候都可以實現相當大的改進。

FLIM系統的第二個重要參數是光子效率，光子效率描述了系統探測到的單個光子對結果的貢獻程度。換句話說，它描述了系統與理想信噪比SQRT（N）的接近程度。雖然TCSPC系統接近理想，但光子效率通常可以通過使用正確的TCSPC定時參數，避免記錄背景信號以及使用足夠快IRF的探測器來優化。通常，光子效率提高兩到四倍是可能的，只需遵守一些簡單的信號記錄規則即可。

當記錄和分析多指數衰減函數時，數據質量變得尤為重要。在最常見的FLIM應用中，多指數衰減是必須的。然后，信息主要在于衰減分量的振幅和壽命，而不是凈衰減函數的表觀壽命。這意味著不僅探測效率和光子效率很重要，儀器響應函數IRF的寬度也很重要。此外，解析多指數衰減函數的選項在很大程度上取決于衰減函數的形狀，它們偏離單指數曲線的距離越大，就越能很好地分辨它們。因此，考慮好FLIM選項的實驗規劃和樣品優化設計可以對研究的結果產生巨大影響。

最后，數據分析在任何FLIM實驗中都起著重要作用，正確應用的數據分析可以從記錄的數據中提取最大數量的信息。此外，它能夠以出版就緒的風格呈現數據，令人信服地支持相關出版物中提出的科學主張。

References

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翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。

第三部分：最大化光子效率

如“信噪比”小節中所述，TCSPC系統能夠達到SNR = SQRT（N）的理論信噪比。然而，這要求探測到的每個熒光光子都會向結果貢獻其最大的信息量。這要求正確配置TCSPC計時（timing）參數，避免記錄背景光子，并以足夠高的精度確定光子時間，這一部分將討論這些要點。

觀測時間間隔

觀測時間間隔可以對壽命的信噪比產生影響。圖 16 顯示了一個示例，采集相同樣品的兩張圖像，采用相同的計數速率和相同的采集時間，激光重復率為50 MHz。在5 ns的觀測時間間隔內記錄了左側圖像，壽命約為2.2 ns，熒光在觀測時間間隔內不會完全衰減，見圖16，第二行左。結果，衰減函數尾部的光子沒有被記錄下來，數據分析過程只能從記錄的部分衰減確定壽命。因此，像素上壽命的分布比理想條件下更寬，參見圖16，左下角。圖 16 中所示的情況非常常見，較短的觀測時間間隔非常適用于壽命極短的樣品，然而，它們也可能無意中被用于較長的使用壽命，從而獲得欠佳的光子效率。

右側的圖像是在12 ns的觀測時間間隔內記錄的，幾乎所有的光子的衰減函數都被記錄下來，數據分析可用整個衰減函數來確定壽命，見圖16的第二行右。因此，壽命的分布（圖16，右下角）比左圖窄。

圖16：在5 ns（左）和12 ns（右）的觀測時間間隔內記錄的圖像。衰減曲線和直方圖顯示在第二行和第三行。

此外，衰減曲線在觀測時間間隔中的位置也會對光子效率產生影響。圖 17 顯示了一個示例。對于左側圖像，衰減曲線未正確放置在觀測時間窗口中，曲線向右移動，因此衰減曲線的遠端不會被記錄。圖 17（左）中參數設置中的錯誤可能看起來微不足道且易于糾正 （參考文獻[2]），但在TCSPC FLIM數據中經常遇到這種情況。

在右側的圖像中，衰減數據被完美地放置在觀測時間窗口中，并記錄了整個衰減曲線。不僅沒有光子的損失，擬合時還具有更大的時間間隔，它可以很好地用于確定壽命值。因此，正確居中的衰減數據的壽命直方圖明顯變窄，見圖17，底部。標準差 σ_τ 為 80 ps，而左側數據的標準差為 118 ps。這是一個1.48的比率，正確居中的衰減數據更佳。σ_τ 中 1.48 的比率可能聽起來不多，然而，它轉化為光子效率是2.18倍。這意味著錯誤配置的系統需要2.18倍的光子數（或2.18倍的采集時間！），才能達到與右側系統相同的壽命精度。

圖17：衰減曲記錄欠佳的影響。在左圖中，衰減曲線被不正確地放置在觀測時間窗口中，衰減曲線的遠端沒有記錄。在右圖中，衰減數據完美地放置在觀測時間窗口中。記錄整個衰減曲線。正確居中的衰減數據的壽命直方圖明顯更窄。

圖 16 和圖 17 中左右的壽命圖像的比較也顯示了另一個效果：
左側圖像中的壽命偏向于較小的值，原因是熒光衰減不是純粹的單指數。慢衰減分量在衰減曲線的尾部最為突出，而它在丟失的部分數據中。當數據分析過程使用單指數模型擬合數據時，它只能優化衰減數據記錄部分的擬合。在這一部分中，慢速分量的表示不足，結果是確定的壽命比實際時間短。采用一階矩技術的情況更糟，由于缺少熒光衰減的尾部，計算的矩太小，因此從一階矩得出的熒光壽命太小。

激光器重復頻率

使用ps二極管激光器的FLIM系統可以在不同的激光重頻下工作，參考文獻[5，6，7]。標準重頻為 20 MHz、50 MHz 和 80 MHz，其他重頻也可按需定制。使用Ti：Sa激光器的多光子FLIM系統以80 MHz的頻率運行，而采用飛秒光纖激光器的系統通常使用40 MHz，參考文獻 [14]。哪種重頻最好？5 ns的熒光壽命是否仍能以 80 MHz 的重頻準確測定？我是否應該總是使用80 MHz，因為它有充足的激發功率？

圖18顯示了染料溶液掃描中選定點的衰減曲線，熒光壽命為5.6 ns。上部曲線以50 MHz獲得，下部曲線以80 MHz重頻獲得，光子數約為20,000，在兩條曲線中大致相同，但這兩條曲線都包含大量來自上一個激發脈沖激發出的光子的“不完全衰減”。當然，在80 MHz的記錄中，不完全衰減的量更高，因為熒光衰減的時間更短。顯而易見，衰減不完全的數據不能用一階矩技術來分析。它們可以使用SPCImage的“不完全衰減”模型進行處理，以這種方式處理圖像會產生圖18中右圖所示的壽命分布。

圖18：染料溶液的熒光衰減函數，5.6 ns熒光壽命。頂部：激光重復率 50 MHz。底部：激光重復率 80 MHz。左側：衰減曲線。右側：像素上壽命的直方圖。

結果是令人意外的：盡管50-MHz曲線看起來更加“分析友好”，但直方圖實際上是相同的。為什么？原因是5.6 ns衰減和另一個5.6 ns衰減的總和偏移了一個周期，仍然是5.6 ns衰減。因此，擬合程序以合理的標準偏差提供正確的壽命值。標準偏差大于20，000光子的理想值，但對于兩個記錄都是相同的。與理想記錄相比的損失來自記錄時間間隔不覆蓋整個衰減的事實，而不是來自存在不完全衰減的事實。圖 19 支持這一點，它顯示50 MHz的記錄，但在20 ns的觀測時間間隔內，壽命分布明顯更窄。

圖19：5.6 ns的熒光衰減，以50 MHz的重頻，記錄在20 ns的觀測時間間隔內。

所以結論是：如果可能的話，使用盡可能覆蓋熒光衰減的記錄時間窗口。如果因為激光脈沖周期太短而無法這樣做，不要擔心，數據分析將處理不完整的衰減，并提取最佳的壽命信息。

計數背景

計數背景不僅是FLIM數據中最常見的缺陷，也是最具破壞性的缺陷。幸運的是，這也是最容易避免的，在大多數情況下，背景只是來自日光的影響。最脆弱的是采用非解掃探測（NDD）的多光子系統，這些系統沒有針孔可以阻擋來自激發點外部的光，它們直接探測樣品散射出來的光子，從樣品表面的大面積區域收集光，這樣做的副作用是它們對環境光也很敏感。因此，必須使系統遠離日光。

圖20顯示了如果衰減數據被背景計數覆蓋會發生什么情況。熒光光子（a）的平均到達時間<t> = τ，時序噪聲為σ_t = τ。我們可以單獨建立熒光光子的光子分布，它將代表真正的熒光衰減曲線（a，右），以σ_τ = τ / SQRT（N）的標準偏差提供熒光壽命，即光子效率為1。背景光子（b）在整個觀測時間窗口（T）上均勻分布，它們的平均到達時間為T/2，時序噪聲為σ_tbkg=0.28 T（見圖24）。

記錄過程在熒光和背景光子之間沒有區別，因此，探測到的信號（c）是熒光衰減和背景的總和。這會導致兩個不利影響：首先，平均到達時間不再是熒光衰減時間τ，相反，它是壽命τ和背景光子平均T/2的光子數加權平均值，因此，數據不能通過一階矩或基于矩的任何其他技術進行分析。

其次，有效定時噪聲是熒光光子的定時噪聲σ_t = τ和背景的定時噪聲σ_tbkd = 0.28 T的加權和。在大多數情況下，0.28 T 大于 τ，因此，它對凈標準差（測量壽命的 σ_τmeas）有很大的影響。精確計算σ_τmeas以及光子效率是困難的，并且提供的結果不容易解釋。上述討論表明，計數背景對探測到的熒光壽命有很大影響。

圖20：計數背景對光子時間的影響

一個實際示例如圖 21 所示，來自同一樣品的FLIM圖像以帶背景（左）和不帶背景（右）記錄。在左圖中，每個像素中的背景約為900計數（所有時間通道的總和），在右圖中接近于零，最亮像素中的熒光光子數量約為4000。因此，背景明顯損害了圖像的對比度，參見圖21，左圖。然而，對比度的損失并不是那么糟糕，但圖像模糊了。右圖沒有背景，因此提供了最大的對比度。

所選點中的衰減曲線顯示在第二行中，左圖的衰減曲線包含背景計數，右圖的衰減曲線不包含背景計數。背景似乎很溫和，看起來不像是一個真正的問題，然而，對壽命準確性的影響是巨大的。這可以在圖21的第三行中看到，它顯示了每個記錄的phasor?plot圖和按一階矩計算的壽命直方圖。可以很容易地看出，左側數據組的直方圖和phasor?plot圖不僅完全偏移，而且極度展寬。原因不僅在于背景為光子數據增加了時序噪聲，還在于背景為矩增加了偏移。由于熒光信號和背景信號的比值隨像素的亮度而變化，因此壽命值被極度模糊。

圖21：計數背景對FLIM精度的影響。左：帶背景計數的 FLIM 數據。右：無背景記錄。上行：圖像。第二行：所選點中的衰減數據。第三行：M1 分析的Phasor plots圖和壽命直方圖。最下行：采用 MLE 分析的壽命直方圖。

圖21的底行顯示了采用MLE分析獲得的壽命直方圖，就壽命移位而言，擬合過程比矩分析做得更好。壽命大約是170 ps，直方圖比右邊的無背景記錄寬兩倍，壽命標準偏差的兩倍轉化為光子效率是相差四倍！

時間通道數

與普遍的觀點相反，衰減曲線中的時間通道數對信噪比沒有直接影響。它沒有出現在一階矩分析推導的SNR方程（“信噪比”小節）中，并且擬合例程進行數據分析并不關心FLIM數據在兩倍的時間通道中是否只有一半的光子數量，反之亦然。只有衰減曲線中的光子總數才重要，圖22給出了實驗驗證。它顯示了一個用Alexa 488染色的樣品，在所使用的探測波長下，整個掃描區域的壽命幾乎是均勻的。第一行中的數據用64個時間通道記錄，第二行的數據用1024個時間通道記錄，圖像中的光子總數幾乎相同。正如預期的那樣，壽命直方圖（第一行和第二行，右）幾乎相同。

圖22：使用不同數量的時間通道，相同的光子總數進行記錄。上排：64 個時間通道。下排：1024個時間通道。從左到右：圖像，光標位置的衰減曲線，單指數擬合，像素上壽命直方圖。與普遍的觀點相反，在64通道記錄中，每個時間通道的光子數量越多，并沒表現出更高的壽命精度。

壽命的SNR與時間通道數無關，這并不意味著可以使用數量任意小的時間通道和任意大的時間通道寬度。在兩個或四個時間通道中進行探測會大大降低光子效率，參考文獻[1，10，16]。當時間通道寬度與IRF寬度的數量級相同時，SNR已經開始下降。這種情況下，不清楚IRF在第一個通道中的位置，以及熒光脈沖的上升開始的位置。這增加了壽命計算的不確定性。根據經驗，IRF和最快的衰減分量都應使用不少于5至10個時間通道進行采樣。這意味著，對于HPM-100-40探測器（IRF寬度120 ps），探測低至100 ps的快速衰減分量，時間通道寬度應約為10 ps。對于 10 ns 的觀測時間間隔，時間通道數應為 1024。對于 HPM-100-06（IRF 寬度<20 ps），將時間通道數增加到 4096（即將時間通道寬度減小到3 ps）是合理的，如果要探測超快衰減分量，采用更窄的時間通道更佳。

IRF——儀器響應函數的影響

如果 FLIM 系統的 IRF 具有非零寬度，會發生什么情況？IRF的影響可以通過觀察光子到達時間來估計。讓我們假設我們已經記錄或以其他方式確定了FLIM系統的IRF，然后，我們可以通過平均IRF測量的光子時間來定義IRF的“質心<t_irf>。如圖6所示，熒光衰減時間τ是通過簡單地從平均光子時間<t>中減去<t_irf>而獲得的，參見圖23，左圖。

圖 23：IRF 寬度不為零的系統中壽命測量的標準偏差。左圖：壽命是光子的平均到達時間 t 減去 IRF 質心的時間，<t_irf>。右圖：測量壽命的標準差 τ_meas 包含 IRF σ_irf 的貢獻。

以這種方式獲得的壽命標準偏差是多少？可以假設標準差仍然是τ / SQRT（N）：IRF的質心是準確的，減去它不會改變t的標準差，但這是不可能的，因為光子時間本身包含來自IRF的不確定性，每個熒光光子定時參考在IRF中都是不同時間。另外，它可能在激光脈沖的不同時間被激發，或者它花了不同的時間通過探測器，這增加了光子時間t的不確定性，并增加了IRF σ_irf對理想光子時間的標準偏差σ_t = τ的貢獻。

因此，測量光子乘以σ_tmeas的標準差大于τ，測量壽命的標準偏差σ_τmeas大于τ / SQRT（N），可以通過下式來進行估算：

σ_τmeas = SQRT (τ² + σ²irf) / SQRT (N)

或

σ_irf也被稱為“計時抖動的RMS值”或 （有點誤導地）“IRF寬度的RMS值”。對于在實踐中遇到的IRF形狀，它大約是IRF半高寬（FWHM）最大值的0.43到0.87。圖 24 給出了幾種典型 IRF 形狀的 RMS 與 FWHM 值。對于高斯IRF，計時抖動的RMS值為0.43 FWHM。對于非對稱函數，這個值會更大。具有慢尾或帶有凸起的IRF會給衰減數據增加更多的時序噪聲，如果可能的話，應該避免使用。請注意，尾部和凸起也可能源于過高功率下工作的皮秒二極管激光器。不利的IRF形狀造成的精度損失實際上可能超過光子數量增加帶來的增益。

圖 24：一些典型 IRF 形狀的 RMS 值。從左到右：矩形、高斯、x?e^-x、有凸起的x?e^-x、指數函數 e^-x 。函數歸一化為相同的FWHM，RMS值以FWHM的倍數給出。

從這個結果中可以得出兩個結論。第一個是，毫不奇怪，SNR仍然與N的平方根一起縮放。第二個是，只有當IRF寬度的RMS大于熒光壽命的約50%至100%時，SNR才會大幅下降。隨著IRF寬度的增加，壽命精度的下降緩慢。這導致了一種誤解，即FLIM系統的IRF寬度并不重要：典型熒光團的熒光壽命在幾納秒的范圍內，因此，如果 IRF 是完全已知的，則 500 ps 到 1 ns（RMS） 的 IRF 寬度應該就足夠了。然而，這與任何實際經驗相矛盾，錯誤出在哪里？

FLIM中的熒光衰減函數不是單指數的，不僅如此，所需的信息通常是在衰減函數的組成中，而不是在凈“壽命”中。在這種情況下，IRF必須比最快的衰減分量快。FRET測量和自發熒光測量中的主要衰減成分分別低至約300 ps和100 ps，參考文獻[2]，HPM-100-40 探測器非常適合這些應用。在蘑菇孢子，參考文獻[12]，人類頭發和哺乳動物皮膚病變中，會遇到低至10 ps范圍的壽命。這些測量需要更快的探測器。示例將顯示在“多指數衰減函數”一節中。

多指數衰減函數

當FLIM僅用作激光掃描顯微鏡中的比對技術時，熒光衰減的單指數近似值及其表觀壽命的測量可能就足夠了。然而，FLIM的真正應用是分子成像。熒光團 – 無論是內源性還是外源性 – 根據其分子環境改變其熒光壽命。這可能與蛋白質，蛋白質結構，蛋白質與其他蛋白質的相互作用，細胞或組織代謝狀態的影響，或參與細胞功能的離子濃度相結合。在這些應用中，任務不是區分不同的熒光團，而是區分不同分子環境中相同熒光團的組分，并通過其相對濃度量化它們，參考文獻[1，4，15]。在大多數情況下，這需要記錄多指數衰減函數，并將它們分成不同的衰減分量。因此，多指數衰減記錄和多指數衰減分析是生物系統的FLIM標準配置。圖 25 和圖 26 顯示了幾個示例。圖30、圖31和圖38顯示了多指數FLIM測量的更多示例。

圖25：頂部：人體視網膜的FLIM圖像，在體記錄。快速、中衰減和慢衰減分量的強度貢獻。底部：圖像選定點的衰減曲線。數據由耶拿大學的Dietrich Schweitzer和Martin Hammer提供。

圖26：通過FLIM對NADH（左）和FAD（右）進行代謝成像。雙指數衰減的振幅加權壽命（tm）、和快速衰減分量振幅a1的圖像。底部：NADH和FAD圖像的選定點中的衰減函數。

從多指數衰減分析中提取單個衰減分量比單指數擬合或一階矩分析需要更多的光子，參考文獻[17]。因此，探測效率和光子效率是關鍵參數。時間分辨率也很重要 – 對IRF寬度的要求是由最快衰減分量的壽命決定的，而不是由凈衰減函數的表觀壽命決定的。

同樣重要的是衰減函數的形狀，它們與單指數衰減的差異越大越好。具有幾乎相同壽命的衰減分量很難或不可能分裂，參考文獻[17]，低振幅的衰減分量也很難提取。圖 27 顯示了三個示例。左圖所示的函數在 2.4 ns 的背景中包含 445 ns 的 82 %。這很容易解決。中間的函數比較困難。快速分量的幅度僅為24%，壽命值接近900 ps，而慢速分量的幅度為2.5 ns。凈衰減函數比左邊的函數更接近單指數。右側的衰減輪廓在視覺上與單指數衰減無法區分。它包含35%的3 ns和65%的4.5 ns，使用FLIM中通常可用的光子數量，無法逐個像素地解析。

圖 27：雙指數衰減函數。左側的函數易于解析，中間的函數難以解析，右側的函數在FLIM數據中幾乎不可能解析。

圖27右所示的情況，如果可能的話，應該在實驗計劃中避免。一個例子是FRET實驗：具有大供體 – 受體重疊的FRET對，和具有短供體 – 受體距離和大比例供體相互作用的FRET結構，以大振幅和短壽命提供供體衰減函數的快速分量。這使得衰減輪廓更容易分辨，從而分離相互作用和非相互作用的供體部分。在某些情況下，如果信號利用光譜進一步分離，結果可以得到極大的改善。衰減分量的數量得以減少，分析變得更加容易。光譜分離可以在激發端和探測端獲得。一個例子是NADH / FAD FLIM的代謝成像。當兩個熒光團以相同的波長激發（正如經常嘗試的那樣）并且僅通過不同的發射濾光片觀察到時，這種情況幾乎是無望的。然而，通過在正確的波長間隔內進行多路復用激發和探測，信號可以很好地分離，參考文獻[15]。因此，在樣品設計和FLIM配置方面進行實驗規劃對結果的質量有很大的影響。

圖28和圖29給出了多指數衰減測量的示例。圖28顯示了NADH溶液的FLIM數據。使用溶液獲得在整個掃描區域均勻的壽命分布。然后，像素上的參數直方圖由光子噪聲決定，而不是由掃描區域的壽命變化決定。在785 nm處用雙光子激發記錄數據，用512 x 512像素，1024個時間通道掃描圖像。從上到下，圖28顯示了使用H7422-40 PMT探測器以及HPM-100-40和HPM-100-06混合探測器記錄的數據。IRF 寬度分別為 250 ps、110 ps 和 18 ps。從左到右，該圖顯示了任意選定點的衰減曲線、快速分量 t1 的壽命直方圖、第二快分量 t2 的直方圖和慢分量 t3 的直方圖。

可以清楚地看到，隨著IRF寬度的減小，壽命直方圖變得更窄。有趣的是，這不僅適用于快速分量，也適用于中慢分量。使用 HPM-100-06 獲得最佳結果，即 IRF 寬度為 18 ps。使用如此快速的IRF記錄的衰減數據幾乎不受IRF引起的計時抖動的影響。HPM-100-06的t1、t2 和 t3 的直方圖比 H7422 窄 1.4 倍，這意味著它的光子效率高出2倍。

圖28：NADH溶液，用不同探測器記錄的數據。上排：H7422-40探測器，IRF寬度250 ps。第二排：HPM-100-40，IRF 寬度 110 ps。下排：HPM-100-06，IRF 寬度 18 ps。從左到右：任意選定點的衰減曲線，快速分量的直方圖，t1，第二快分量的直方圖，t2，慢分量的直方圖，t3。雙光子激發，非解掃描探測，圖像512×512像素，1024個時間通道，約5000個光子在合并區域里。

圖29給出了對壽命低于25ps的超快衰減分量探測的示例。這種快速分量很常見，我們經常在人類的頭發，蘑菇孢子和哺乳動物皮膚的痣中發現它們。在黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的熒光衰減中也存在一種快速分量，FAD是一種存在于每個細胞中的天然熒光團。FAD很重要，因為它的熒光衰減函數包含有關細胞代謝狀態的信息。

圖29顯示了FAD溶液的FLIM圖像。從左到右，該圖顯示了快速衰減分量 t1、三重指數擬合的衰減曲線和 t1 直方圖的圖像。上行的數據用HPM-100-40探測器記錄，下排的數據用HPM-100-06記錄。從視覺上看，HPM-100-40（IRF 110 ps FWHM）記錄的衰減曲線沒有顯示出快速分量的痕跡。但是，仔細的數據分析會提取一個使用壽命約為20 ps的分量。除非明確搜索，否則不易發現。整個圖像上 t1 值的直方圖顯示在右側。
用HPM-100-06（IRF寬度18 ps FWHM）記錄的數據。衰減曲線令人信服地表明，快速分量確實存在。在圖像的選定位置進行數據分析，最快的分量的壽命為16.5 ps（其他兩個分量分別為2.2 ns和3.2 ns）。直方圖顯示最常見的 t1 值約為 16 ps。

正如對快速IRF所預期的那樣，直方圖比HPM-100-40的數據窄了近2倍。

圖29：FAD溶液的熒光。從左到右：快速衰減分量t1的圖像，三重指數分析的衰減曲線，t1的直方圖。上排：用 HPM-100-40 探測器記錄，IRF 寬度 110 ps FWHM。下排：使用 HPM-100-06 探測，IRF 寬度 18 ps FWHM。

IRF 寬度 vs 探測器效率

應該注意的是，探測器的IRF寬度與探測效率之間存在潛在的取舍。快速探測器具有傳統的雙堿光陰極，因此，它們的靈敏度比GaAsP探測器低約4倍，但沒法知道更快的IRF和更高的靈敏度誰更重要。當然，為了解析超快衰減分量，沒有辦法繞過快速IRF，無論您是實際看到快速分量還是必須通過反卷積將其從數據中擠出。我們還發現，使用低于20ps的IRF對NADH和FAD數據的雙指數和三指數衰減分析更可靠，參考文獻[2，13]，這也可以在圖28的底部看到。在實踐中，探測器的選擇取決于樣品的光穩定性。如果樣品在四倍的激發功率下或四倍的采集時間內依然保持穩定，則選擇快速IRF的探測器。反之，則必須使用GaAsP探測器。

References

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。

第二部分：優化（增加）光子數

激發功率

當FLIM用戶希望增加光子數時，第一個想法通常是增加激發功率。這當然是獲得更多光子的有效方法，但它并不總是有助于獲得更好的FLIM結果。FLIM實驗通常在熒光團濃度低的樣品上進行，原因是只有當熒光團本身對細胞的活力或其代謝功能沒有明顯影響時，才能看到分子效應。此外，熒光團可能具有較低的量子效率。如果增加激發功率，分子必須執行更多的激發–發射循環，結果是光漂白，形成自由基，激光誘導壽命變化，光損傷，甚至樣品完全被破壞。然后，成像過程不再是非侵入性的，FLIM結果變得毫無意義。因此，增加激光功率的選擇是有限的（參考文獻[8]）。侵入性效應的幾個例子如圖8所示。

圖8：左：Convallaria圖像，用405nm激光掃描的中心區域。中：活細胞的雙光子NADH圖像。在明亮的紅色斑點中，發生了光損傷，通過非常快速衰減的斑點表現出來。右圖：酵母細胞的時域馬賽克拼接FLIM圖像，采用780nm雙光子激發。記錄從左下角開始，一直到拼接圖的右上角。破壞從第8和9格開始，一直持續到第16格。

采集時間

與增加激發功率不同，增加采集時間通常是一種不錯的選擇，損傷效果是高度非線性的。通常，可以用僅略低于損傷閾值的功率長時間掃描樣品，可增加光子數，所需要的只是實驗者的耐心。圖 9 顯示了一個示例。左邊的圖像采集時間為1分鐘，右邊的圖像采集時間為2分鐘。結果是，右邊的圖像包含2倍以上的光子。正如預期的那樣，它還提供了1.4倍的壽命SNR，參考圖像下方的壽命直方圖。

圖9：以不同的采集時間對同一樣品進行成像，左圖 1 分鐘，右圖2 分鐘。圖像格式512×512像素，1024個時間通道。

雖然光子數（以及壽命精度）和采集時間的相關性是微不足道的，但FLIM用戶通常不會意識到這一點。特別是來自傳統基于強度的成像的用戶，當達到強度圖像的合理SNR時，往往會停止采集。但是，這存在一個謬誤。當強度圖像每像素包含不超過幾十個光子時，它開始看起來不錯。這種圖像的SNR可能足以區分不同的熒光團，但不足以從熒光壽命中得出所需的分子信息。因此，請確保采集時間足夠長。我們的SPCM采集軟件提供了許多選項，用于在采集過程中查看光子數。您可以在所選像素或感興趣區域中顯示衰減曲線，可以在最亮的像素和所選像素中顯示光子數，并且可以在線顯示壽命圖像。請參見圖 10，使用這些選項，您應該能確定到目前為止記錄的數據是否足以進行進一步分析。如有不夠，請記錄更長時間。

圖10：SPCM幫助用戶確定是否記錄了足夠光子數的功能。從左到右：在線壽命圖像，選定位置的衰減曲線，最亮像素（頂部）中的光子數和數據點位置的光子數。

有時有人反對說，當要觀察生理變化時，無法采用較長的采集時間。然而，如果使用適當的多維TCSPC技術，這并不一定，請看（參考文獻[2，9]）。

顯微物鏡

顯微鏡物鏡的數值孔徑對探測效率有顯著影響。熒光以各向同性方式發射，只有一部分被顯微物鏡收集。從理論上講，收集效率隨著數值孔徑的增加而成平方倍增加。這意味著NA 1.25的物鏡應該比NA 0.5的物鏡收集6倍以上的光子數。但在實踐中，差異會小一些，因為高數值孔徑物鏡具有更多的光學元件和更低的透過率。然而，收集效率的差異是驚人的。圖 11 顯示了一個示例。兩幅圖像都采用單光子激發和共聚焦探測記錄的。左圖像用NA 0.5的x20空氣鏡記錄，右圖像用NA 1.25的x63油鏡記錄。使用高數值孔徑物鏡記錄的圖像包含的光子是低數值孔徑下記錄的圖像的三倍。

圖11：使用不同NA的物鏡記錄的FLIM圖像，相同的強度尺度，單光子激發，共聚焦探測。左：X20 空氣鏡，NA 0.5，右：X63油鏡，NA 1.25.

聚焦

對焦不佳通常被認為是空間分辨率欠佳的來源，同時，它對探測效率也有顯著影響。圖 12 顯示了一個示例，兩幅圖像均通過共聚焦掃描記錄，針孔尺寸相同，采集時間相同。左圖略微失焦，盡管如此，圖像清晰度只是略受損。右圖完全對焦。可以很容易地看出，正確對焦的圖像更亮。與失焦圖像相比，光子的數量大約高出1.5倍。由于FLIM系統顯示強度歸一化圖像（這樣做是因為強度的差異可能時數量級的），因此通常不會注意到這些差異。因此，當您在“預覽”模式下進行最終對焦時，請花幾秒鐘在關閉自動縮放功能的情況下優化對焦。

圖 12：左圖略微失焦，右圖完全對焦。相同強度尺度，單光子激發，共聚焦探測。雖然失焦圖像中的圖像清晰度僅略受損，但光子數僅為完美圖像中光子數的60%。圖像格式512 x 512像素，1024個時間通道。

光學系統的對準

光學系統的對準對探測效率有巨大的影響，共聚焦系統尤其如此。共聚焦對準非常關鍵，幾乎沒有一個共聚焦系統可以長時間保持完美對準。圖 13 顯示了一個示例，左邊的圖像是在針孔對準稍微偏離的情況下采集的，幾乎在任何共聚焦系統中都可以發現這樣水平的失準。通常，它不被注意到，因為圖像清晰度幾乎沒有受到損害。然而，與來自完美對準系統的圖像進行比較（圖13，右），記錄的光子數量存在明顯的損失。某些情況的失準甚至導致圖像清晰度可見的下降，可導致光子數的巨大損失，在這些情況下，效率下降一個數量級甚至更多并不罕見。

圖 13：共聚焦對準的效果。左：略微失準。右：完美對準。雖然不對準尚未導致圖像清晰度的可見下降，但它會導致50%的光子損失。

在非解掃探測（NDD）的多光子系統中，失準甚至也可能導致影響。雖然這些系統的探測光路很可靠，很少失準，但激發光路卻存在失準的可能。多光子顯微鏡的飛秒激光需要空間光耦合到掃描頭中，這為光路提供了許多可能偏離對準的可能，這導致激光不再集中在顯微物鏡的后孔徑中間。結果，聚焦質量下降，激發效率降低，光漂白和光損傷并不總是以相同的比例減少，特別是如果樣品在激光的本身的波長上有一定的吸收。因此，多光子系統也應該定期重新對準。這可以通過檢查激光束在物鏡后孔徑上的位置，并將其調回中心來輕松完成。

探測器

多年來，激光掃描顯微鏡，特別是FLIM系統，一直使用傳統的光電倍增管（PMT）作為探測器。PMT具有較大的有效面積，每平方毫米有效面積的暗計數率極低，并且有足夠的增益和速度來探測單個光子。具有常規光陰極的PMT的光陰極的量子效率約為20%，然而，并非每個由陰極發射的光電子都進入放大系統并提供有用的單電子脈沖。因此，凈效率約為15%。隨著采用帶有GaAsP陰極的PMT，效率有所提高，這些陰極的量子效率接近50%。如濱松的H7422 GaAsP PMT，已經用于FLIM多年。然而，這些探測器的儀器響應（IRF）寬度約為250至350 ps，這對于高端FLIM應用來說是不夠的。隨著濱松R10467-40混合型PMT的推出，情況完全改變了，混合型PMT的原理保證了幾乎所有離開陰極的光電子都能提供單電子脈沖。憑借其GaAsP光電陰極，R10467-40的凈探測效率達到50%。IRF快速而干凈，并且沒有像傳統PMT那樣的后脈沖背景。但R10467-40不易使用，它需要 -8000 V 和 +400 V 電源電壓、可靠的過載保護、高增益前置放大器和出色的射頻屏蔽。bh是第一個解決這些問題的公司，并將這種探測器完全應用到其FLIM系統（參考文獻[11]）。不同探測器效率的比較可以在“bh TCSPC手冊”（參考文獻[2]）的“TCSPC探測器”一章中找到。

圖 14 顯示了一個實際示例。左邊的圖像是用傳統的PMT（bh PMC-100-0模塊）記錄的，右邊的圖像是用GaAsP混合型PMT（bh HPM-100-40模塊）記錄的。采用GaAsP混合探測器的光子數約為4.2倍。

圖 14：使用傳統 PMT（bh PMC-100-0，左）和混合型 PMT（bh HPM-100-40，右）記錄的 FLIM 圖像。相同的成像條件，相同的采集時間。HPM-100-40圖像包含的光子是使用傳統PMT拍攝的圖像的4.2倍。

像素數

獲得的壽命的SNR與每個像素的光子數成正比。因此，原則上，光子限制條件下的SNR可以通過減少像素數量來增加。例如，128 x 128 像素的圖像只需要 512 x 512 像素圖像的 1/16 光子。這種方法的缺陷在于，它用壽命精度與空間分辨率進行了權衡。除非有其他使用低像素數的必要（例如限制的數據大小或需要快速掃描），否則不建議將像素數降低到256 x 256 以下。更好的方法是使用足夠空間采樣的像素數記錄圖像，而在數據分析中使用像素合并（參考文獻[3]），有關詳細信息，請參閱第四部分——“數據分析”。數據分析中的像素合并使像素數保持不變，但會對當前像素及其周圍像素的衰減數據之和運行壽命分析。

其優點是空間分辨率沒有損失，也沒有空間欠采樣，并且您可以自由地在記錄的數據上選擇最佳的像素合并因子。圖 15 顯示了一個示例。頂行的數據以128 x 128像素掃描記錄，底行的數據通過512 x 512像素掃描記錄，兩個記錄都包含相同的光子總數。因此，512 x 512 像素掃描的每像素光子數要低 16 倍。然而，較低的光子數可通過數據分析軟件中的像素合并來補償的。因此，每個合并區域（底行）的衰減曲線包含與每個像素衰減曲線（頂行）相同的光子數。因此，兩個記錄的壽命直方圖（如右圖所示）具有相同的寬度。但是，來自512 x 512像素掃描的圖像（底行，左）比來自128 x 128像素掃描的圖像（頂行，左）清晰得多。請參閱“數據分析”部分。

圖 15：使用不同像素數記錄的 FLIM 數據。相同的采集時間，相同的光子總數，上行128 x 128 像素，下行 512 x 512 像素。從左到右：圖像、光標位置的衰減曲線、壽命直方圖。使用像素合并對512 x 512像素的圖像進行分析，以補償每像素的較低光子數。

References

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。

優質的FLIM圖像

圖1：BPAE樣品的FLIM圖像，2048 x 2048像素，衰減函數記錄在256個時間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統，bh SPCImage FLIM 數據分析軟件。

是什么造就了一個好的FLIM圖像？它應該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素數、高對比度、低背景噪聲，沒有失焦模糊，并且它應該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經驗的FLIM用戶可能會補充說，僅僅記錄熒光壽命是不夠的，整個衰減函數應該記錄在每個像素中。

為什么發表在科學論文中的FLIM圖像很少看起來像上面的圖像？這實際上沒有任何理由。所有要做的就是使用完美對準的光學元件，正確的顯微物鏡，完美的聚焦，正確的激發和探測波長，正確的探測器以及一點點耐心。對FLIM的信號處理原理的一些理解也可能有所幫助，這些是每個FLIM用戶都可以實現的。

本文介紹了獲得出色的 FLIM 結果的重要因素，給出的大多數建議都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是這些瑣碎事物的總和，使得完美的FLIM結果區別于平庸的FLIM結果。

第一部分：TCSPC FLIM結果是光子的分布

TCSPC FLIM原理

追求完美FLIM結果的道路始于理解TCSPC FLIM結果是光子的分布，參考文獻[1]。記錄過程的基本原理如圖2所示。

通過高頻脈沖激光束掃描樣品，探測器探測發射的熒光單光子，并由TCSPC系統測量激光脈沖周期內每個光子的到達時間t。同時，TCSPC系統確定激光束在光子探測時刻的空間坐標x，y。從這些數據中，光子在空間坐標上和時間上的分布被建立起來。這種光子分布是期望的壽命圖像：它是x*y像素的數據陣列，每個像素都包含大量連續時間通道中的熒光衰減函數。參見圖 2右。記錄過程及其各種擴展的詳細說明可以在文獻[2]中找到。

圖2：TCSPC FLIM原理

圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個水平 x 128 垂直像素的圖像區域。每個像素有256個時間通道，包含該像素的衰減數據。當然，真實的FLIM圖像具有更高的像素數。常規FLIM為采用256至1024個時間通道的512 x512像素的格式，并且已經演示過采用256個時間通道的2048 x 2048像素的格式，參考文獻[2]。

對于沒有經驗的用戶來說，圖3中所示的分布可能看起來非常“嘈雜”：單個像素中的熒光衰減幾乎看不見。當然，這些“噪聲”不是由探測器或TCSPC電子設備的任何噪聲引起的，它只是一種光子統計的效應，噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時間通道上。因此，每個像素的光子數都很低，特別是在每個像素中各個時間通道中的光子數更低。那么，如何降低光子分布中的“噪聲”呢？唯一的方法是記錄更多的光子，見圖4。

圖3：TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區域，每個像素有256個時間通道，每個時間通道都包含熒光衰減周期內連續時間的光子。

圖4：與圖3所示的光子分布相同，但記錄的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，單個像素中的熒光衰減曲線清晰突出。

信噪比——SNR

從這些數據中得出的熒光壽命的信噪比是多少？我們從一個簡單的實驗中獲得答案。

根據定義，熒光壽命τ是分子保持在激發態的平均時間。當一個分子發出一個光子時，這意味著它從激發態返回基態。FLIM系統探測單個光子并測量它們相對于激發脈沖的時間t，如圖5 a和b。當FLIM系統探測到大量這樣的光子時，它們在激發脈沖后到達探測器的平均時間是分子處于激發態的平均時間，即為熒光壽命，見圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計算平均到達時間，但它存在于光子分布中。

圖5，a和b：光子的探測和激發后一段時間（t）內光子隨時間的分布. c：探測N光子后的光子分布，激發后的平均到達時間<t>是熒光壽命τ. d：到達時間（t）的標準差σ_t，是熒光壽命τ。平均到達時間的標準差 σ_τ 為 τ /SQRT(N).

平均到達時間的信噪比是多少？單個光子到達時間的標準偏差σ_τ與熒光壽命τ本身相同，這是指數函數的性質。如果我們平均大量（ N 個）光子的到達時間，則結果的標準偏差σ_τ隨N的平方根而減小，請參見圖5，d。因此，探測到N個光子后的信噪比，即τ除以其標準偏差σ_τ的比值為：

SNR_τ = τ / σ_τ = SQRT (N)

這意味著可以獲得熒光壽命的標準偏差只是衰減曲線中光子數量的平方根，參考文獻[17]，這在幾個方面是一個了不起的結果。首先，像素壽命的信噪比與像素強度的信噪比相同，這否定了FLIM比穩態成像需要更多的光子（因此需要更多的采集時間）的普遍觀點。其次，信噪比僅取決于N，特別是，不依賴于記錄熒光衰減的時間通道數。換句話說，您可以增加時間通道的數量，以提高時間分辨率或減少采樣偽影，而不會影響信噪比。第三，由于SNR僅依賴于N，因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結果的關鍵，也是下一部分的主題。

光子分布的一階矩

如上所述，單指數衰減（或單指數衰減近似）的熒光壽命可以通過計算光子的平均到達時間來獲得。如果光子的單個到達時間不可用，則可以通過從完整的光子分布中計算“一階矩” M1 （參考文獻[18]）獲得平均到達時間：

上述等式中的時間t，是光子在FLIM系統的觀測時間間隔內的時間，而不是從激發脈沖之后的時間。因此，必須減去激發時間（在實踐中是IRF的一階矩）才能得到熒光壽命τ：

τ = M1_fluorescence ?M1_IRF

該方法如圖2所示。藍點是各個時間通道中的光子數，綠色曲線是IRF，紅色曲線是通過用IRF卷積指數函數e^-t/τ來計算的假設熒光衰減函數。

圖6：熒光壽命的一階矩計算，熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。

一階矩技術以理想的信噪比提供單指數衰減的時間。但是，它不會提供多指數衰減函數的參數，并且如果記錄包含背景計數，或只有一部分衰減函數位于TCSPC系統的觀測時間間隔內，則它不會提供正確的衰減時間。因此，它幾乎完全被曲線擬合技術所取代。然而，一階矩技術有其優點：它可在非常低的光子數下可靠地工作，適用于在線FLIM應用中的快速壽命測定，最重要的是，它提供了一種在理想和非理想條件下估計FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。

SQRT（N）關系的實驗驗證如圖7所示。以不同的采集時間掃描染料溶液，以獲得每像素包含約200，1600和9000個光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個像素中熒光壽命的直方圖，它是用一階矩分析獲得的，σ_τ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出，σ/τ確實非常接近于SQRT（N）。圖 7 的底行顯示了通過 MLE（最大似然估計）擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些，而且MLE結果也接近SQRT（N）的理想信噪比。

圖 7：SQRT （N） 關系的驗證。頂行：來自羅丹明110染料溶液的FLIM數據單個像素的衰減曲線。從左到右：N = 200個光子，N = 1600個光子，N = 9000個光子。第二行：通過一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行：通過 MLE 分析獲得的壽命直方圖。

光子效率

探測到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測量的準確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計時參數而丟失，其探測時間可能因探測器傳輸時間的不確定性而受損，或者可能存在來自背景信號的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下，獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT（N）。這種情況可以用“光子效率”E來描述。E的倒數表示與理想系統相比，非理想系統需要多少光子才能達到相同的信噪比。由于SNR與光子數的平方根成比例，光子效率也可以寫為

E = (SNR_real / SNR_ideal)²

光子效率E是“品質因數”的平方，有時用于比較不同壽命測量技術的效率（參考文獻[10，16]）。正確配置的TCSPC系統在最佳條件下工作，其光子效率接近1，達到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。

References

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